重组慢病毒包装服务

慢病毒服务简介:

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞, 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的儿率大大增加,能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。所以,在体外实验及体内实验的研究中,慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一, 并且正在获得越来越广泛的应用。

服务价格及周期:

编号 表达基因或shRNA 滴度 价格 周期
MBD-001 表达基因(<2K) 1×108 TU 3000元 3~4周
MBD-002 2×108 TU 4500元 3~4周
MBD-003 其他 询价 3~4周
MBD-004 表达基因(2K~3K) 1×108 TU 4000元 3~4周
MBD-005 2×108 TU 6000元 3~4周
MBD-006 其他 询价 3~4周
MBD-007 表达shRNA(单条) 1×108 TU 3000元 3~4周
MBD-008 2×108 TU 4500元 3~4周
MBD-009 更高滴度 询价 3~4周
MBD-010 表达shRNA(三条,保证至少一条有效) 1×108 TU 10000元 3~4周
MBD-011 更高滴度 询价 3~4周

备注:以上价格仅仅是病毒包装的价格,不包含基因和载体构建的费用。

慢病毒对照价格及周期:

编号 服务内容 滴度 服务价格(元) 服务周期
MBD-012 绿色荧光;表达基因用对照 l x108TU 1500 现货
MBD-013 2×108TU 2500 现货
MBD-014 更高滴度 询价 2-3周
MBD-015 红色荧光;表达基因用对照 l x108TU 1500 现货
MBD-016 2×108TU 2500 现货
MBD-017 更高滴度 询价 2-3 周
MBD-018 绿色荧光;表达shRNA用对照 l x108TU 1500 现货
MBD-019 2×108TU 2500 现货
MBD-020 更高滴度 询价 2-3周

慢病毒包装系统组成:

慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。慢病毒表达载体,即通常所说的穿梭载体,包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装, 包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染。现在的慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。其中四质粒系统比三质粒系统在生物安全性上更好一些,所以应用较多。

慢病毒包装系统载体选择:

目前市面上常见的商业化慢病毒包装系统较多,其中常用的有Clontech 、Invitrogen 等公司的相关产品。本公司通过大量实验摸索,博采众家之长,建立起了一套稳定、可靠、高效的慢病毒包装系统。这套慢病毒包装系统, 其穿梭载体主要来自Clontech公司,包括以下载体:

载体名称 出品公司 用途 启动子 荧光标记 真核筛选标记
pLVX-DsRed-Monomer-Nl Clontech 表达基因 CMV 红色荧光 Puro
pLVX-AcGFPI-N1 Clontech 表达基因 CMV 绿色荧光 Puro
pLVX-IRES-tdTomato Clontech 表达基因 CMV 红色荧光
pLVX-lRES-ZsGreen1 Clontech 表达基因 CMV 绿色荧光
pLVX-lRES-Neo Clontech 表达基因 CMV Neo
pLVX-lRES-puro Clontech 表达基因 CMV Puro
pLVX-shRNA1 Clontech 表达shRNA hU6 Puro
pLVX-shRNA2 Clontech 表达shRNA hU6 绿色荧光

转染了红色荧光蛋白载体或绿色荧光蛋白载体24小时后的病毒包装293-t细胞荧光显微镜观察结果:

您可以根据需要,选用合适的穿梭载体来装载目的基因或者目的shRNA。在实际使用过程中,我们采用Clontech配套的慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2.G(或Invitrogen公司的pLPl 、pLP2 、pLP/VSVG质粒)。

客户须知:

  1. 上述价格均不包括运输费用。如果您需要干冰运输,按照30元/公斤干冰计算,一般需要加10公斤干冰,即干冰运输费用在300元左右。如果采用超低温冰袋运输,则运输费用由AXYBIO公司承担。我们将采用顺丰快递寄送,全国大部分城市隔天到货。
  2. 如客户所需包装的目的基因由客户提供,则客户应提供所要构建慢病毒的目的基因的序列及其它相关说明信息(例如装载载体、质粒图谱、酶切位点等)。客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
  3. 如客户订购基因过表达的慢病毒,我们承诺交付的慢病毒的滴度不低于107TU/ml,如果低于此滴度,我们将免费重新提供。如果重新提供的病毒还是达不到要求,我们将做退单处理,客户不需支付任何费用。我们会尽量提供高滴度的慢病毒产品,但考虑到慢病毒包装对外源表达框的限制,外源表达框较大时,病毒滴度会受到较大影响,因此,如病毒出毒实际滴度介于107TU/ml和108TU/ml之间,我们将按实际滴度出货。表达shRNA的慢病毒,出毒滴度一般都可以达到108TU/ml。
  4. 如果shRNA序列由客户提供,则本公司只负责证明包含有该shRNA序列的慢病毒构建成功,而不对其干扰效率做任何保证。
  5. 如客户需委托本公司使用包装好的慢病毒感染目的细胞,建立稳定表达目的基因或目的shRNA的细胞系,则相关实验费用另外计算。

附:慢病毒包装和滴度测定流程

1 表达基因用慢病毒包装载体准备:

编号 服务描述 服务周期
1 客户选择目的基因、穿梭载体,AXYBIO公司负责实验设计 1 – 2 周
2 客户提供目的基因,或从AXYBIO cDNA库中购买该基因 1周
3 将目的基因的CDS 区构建至穿梭载体上 2 – 3 周

2 表达shRNA 用慢病毒包装载体准备:

编号 服务描述 服务周期
1 客户选择靶基因或目的shRNA、穿梭载体, AXYBIO公司负责实验设计 1 – 2 周
2 将目的shRNA 构建至穿梭载体上 2 – 3 周
3 有效shRNA 筛选(三条shRNA,保证至少一条shRNA干扰效率在70%以上) 3 – 4 周

3 质粒准备和转染

将3或4种质粒混合于15 ml灭菌管中,采用Opti-MEM和Lipo2000进行转染,转染方法参考Lipo2000标准PROTOCOL和本公司的实际经验。

4 收集第一轮的培养基上清

(1)转染后的细胞CO2培养箱48 h,37℃,收集上清。
(2)收集的上清,4℃ 8000g离心10 min,除去细胞碎片,0.45 μm PVDF膜过滤。
(3)所得病毒液一部分用于测定病毒滴度,其余可冻存于-80℃。
(4)加入10ml新鲜的DMEM+2%NBS培养基。

5 收集第二轮的培养基上清

(1)加入新鲜培养基后,培养24小时。
(2)收集的上清,4℃ 8000g离心10 min,除去细胞碎片,0.45 μm PVDF膜过滤。
(3)所得病毒液一部分用于测定病毒滴度,其余可冻存于-80℃。

6 病毒的浓缩:离心方法采用差速离心法

(1)病毒上清经0.45 μm滤膜处理,于4℃ 10,000g离心15 min。
(2)上清转移至另一干净离心管中,滤液在4℃,40,000g离心2 h。
(3)离心管置于冰浴条件下,用1%体积的DMEM+10% NBS重悬沉淀,重悬时使用同一吸管以避免损失,约每15 s吹打1次,避免产生气泡。

7 测定病毒滴度(荧光显微镜计数)

(1)滴度测定前,以0.5×105浓度种细胞293T于24孔板,每孔1 ml细胞培养基,过夜(12 h)培养使细胞在板底部形成单层,此时细胞密度大约为1.0×105
(2)取10 μl病毒液+90 μl培养基,依次稀释得到10-1至10-8病毒稀释液。24孔板依次加入梯度稀释的待测病毒样品20 μl,留一孔作为对照不加病毒,培养2天。
(3)荧光计数:荧光显微镜下计数带有荧光的细胞数目
(4)计算病毒滴度:荧光细胞数目×稀释倍数(10、102…108)/接种病毒

 

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