重组腺相关病毒包装

服务简介:
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是简单的非病原单链DNA,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白, rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时,病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究,重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解,尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中,rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验);同时作为一种有特点的基因转移载体,还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型,制备基因敲除鼠等方面。
爱科博生物采取的三质粒共转染系统进行重组腺相关病毒的包装服务,包括从实验设计到载体构建、病毒包装、生产、纯化、质量鉴定等全套服务,为基础研究、临床研究的广大科研客户提供高纯度、高质量、高滴度的重组腺相关病毒。

AAV特点:
1 安全性高:迄今从未发现野生型AAV 对人体致病,重组 AAV 基因组序列上去除了大部分的野生型 AAV 基因组元件,进一步保证了安全性;
2 免疫原性低:AAV2的基因组仅 4681 个核苷酸,便于用常规的重组 DNA技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;
3 宿主范围广:能感染分裂细胞和非分裂细胞;
4 表达稳定:能介导基因的长期稳定表达;
5 物理性质稳定:在60℃不能被灭活,能抗氯仿;

AAV载体不同血清型

研究发现 AAV 具有多种血清型,各种不同血清型的 AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同,因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前爱科博生物在包装腺相关病毒时有9种不同的 AAV 血清型可供客户选择,建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒,见下表。

不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性

血清型 组织亲和性
AAV2 中枢神经,肌肉,肝脏,脑组织,眼,
AAV5 肺,眼,中枢神经,关节滑膜,胰腺
AAV8 肝脏,眼,中枢神经,肌肉
AAV9 心脏,肌肉,肺(肺泡),肝脏,中枢神经

服务价格及周期:

编号 表达基因或shRNA 滴度 价格 周期
AAV-001 表达基因(<2K) 1×1012 VG 3600元 2~3周
AAV-002 其他 询价 2~3周
AAV-003 表达基因(2K~3K) 1×1012 VG 3600元 2~3周
AAV-004 其他 询价 2~3周
AAV-005 表达shRNA(单条) 1×1012VG 3600元 2~3周
AAV-006 更高滴度 询价 2~3周
AAV-007 表达shRNA(验证三条,保证至少一条有效,包装一条) 1×1012 VG 6800元 2~3周
AAV-008 更高滴度 询价 2~3周

客户须知
1、默认情况下,我们提供1ml腺相关病毒~1×1012vg/ml。
2、通常小鼠肌肉注射的用量为1×1010~3×1011vg之间,中等剂量是1×1011vg左右;
3、我们将采取分步收费的方式,即按照所提供的构建,包装及纯化的一系列不同的服务,根据客户的实际需要,对每项服务进行具体的核算。腺相关病毒包装服务—— 穿梭载体:pAAV-MCS vector,pAAV-hrGFP vector,pAAV-IRES-hrGFP vector。包装细胞:AAV293。
4、本公司目前不提供致癌基因及毒基因等对人体有危害的基因的包装服务。
5、如客户所需包装的目的基因由客户提供,则客户应提供所要构建腺病毒的目的基因的序列及其它相关说明信息。客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
6、包装好的产品批量储存的最佳条件为-80°C。
服务承诺:
1、默认情况下,本公司包装的病毒只提供PCR检测和转染后的荧光照片结果,如果需要其他结果,客户根据自己的需要可以自行选择;
2、插入穿梭载体目的基因的测序报告,对于需要包装病毒的客户,将提供初步纯化的病毒液5×1012颗粒数/ml的病毒1ml以上,如客户需要纯化病毒,我们将根据与客户达成的协议提供1012-13颗粒数/ml以上的纯化后的病毒液,并附上一份QC报告;
3、公司为实验室研究者提供可用于细胞和动物实验的研究级AAV病毒载体的构建和制备服务,客户在24-36个工作日内获得>1014 vg 的AAV病毒载体。

附:腺相关病毒包装和滴度测定流程

表达基因用腺相关病毒包装载体准备:

编号 服务描述 服务周期
1 客户选择目的基因、穿梭载体,AXYBIO公司负责实验设计 1–2 周
2 客户提供目的基因,或从AXYBIO cDNA库中购买该基因 1周
3 将目的基因的CDS 区构建至穿梭载体上 2 – 3 周

表达shRNA 用腺相关病毒包装载体准备:

编号 服务描述 服务周期
1 客户选择靶基因或目的shRNA、穿梭载体, AXYBIO公司负责实验设计 1 – 2 周
2 将目的shRNA 构建至穿梭载体上 2 – 3 周
3 有效shRNA 筛选(三条shRNA,保证至少一条shRNA干扰效率在70%以上) 3 – 4 周

质粒准备和转染

(1)质粒的混合(以转染10 cm培养皿为例)
将3种质粒混合于1.5 ml灭菌管中,加Special H2O至总体积为50 μl,混合比例根据上面实验结果得出。
(2)加50μl 10× CaCl2至上述1.5 ml灭菌管中,并加水补足500μl。
(3)在装有500μl 2×HeBs的管中逐滴加入CaCl2与DNA的混合溶液(此过程要求在一分钟内完成),加入的同时在振荡器上振荡或用移液器吹打溶液。
(4)混合物于室温下静置5min。
(5)将混合物(1 ml)分散逐滴加入培养皿中(10 cm皿中10 ml细胞培养基)。
(6)放入培养箱过夜培养,培养条件37℃ 5%CO2
(7)观察细胞。此时细胞应该长成单层,并在荧光显微镜下观察转染效率,转染效率应该在90%以上。
(8)更换培养基,加入10ml DMEM+2% FBS 培养基37℃ 10%CO2 培养过夜。

收集病毒

转染48小时后,用枪头把293A细胞吹打下来,连同细胞培养上清一起收集到15ml离心管中,1000g离心5min,取上清,-80℃保存;沉淀的细胞重悬于1ml PBS中,-80℃/37℃反复冻融3次,10000g离心10分钟,取上清,-80℃保存。

测定病毒滴度(荧光显微镜计数)

(1)滴度测定前,以0.5×105浓度种细胞AAV-293于24孔板,每孔1 ml细胞培养基,过夜(12 h)培养使细胞在板底部形成单层,此时细胞密度大约为1.0×105
(2)取10 μl病毒液+90 μl培养基,依次稀释得到10-1至10-8病毒稀释液。24孔板依次加入梯度稀释的待测病毒样品20 μl,留一孔作为对照不加病毒,培养2天。
(3)荧光计数:荧光显微镜下计数带有荧光的细胞数目
(4)计算病毒滴度:荧光细胞数目×稀释倍数(10、102…108)/接种病毒量

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