443143416货号：A103-5
规格：500rxn（1.0 ml×5支）
保存：-20℃避光保存两年
【产品概述】
本产品是采用探针法进行Real Time PCR（qPCR）检测的试剂。核心组分是基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶，配合针对qPCR优化的反应缓冲液，实现了对PCR抑制物耐受性高、扩增特异性高、扩增效率高、检测灵敏度高等特点。本产品是2×浓度的Premix型试剂，配制qPCR反应体系十分简便。同时，本产品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR产物的交叉污染，数据更准确。使用时只需加入模板、引物、探针和水，使其工作浓度为1×，即可进行反应。此外，本产品适用于快速PCR，可以在宽广的动态范围内对靶基因进行准确定量，检测重复性好，可进行可信度高的Real Time PCR分析。
本品特点：使用化学法修饰的热启动酶，提高灵敏度，增强特异性；使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前扩增产物的交叉污染，数据更准确；针对qPCR优化的反应缓冲液，增强特异性，减少引物二聚体形成，提高扩增效率，重复性好，可信度高。
本品不含有用以校准孔间荧光信号差异的ROX Reference Dye，适用于Bio-Rad iCycler CFX96，CFX384，iQ，iQ5，MyiQ，Opticon, Opticon 2，MiniOpticon，Chromo4，Qiagen Corbett Rotor-Gene Q，Rotor-Gene 3000，Rotor-Gene 6000，Eppendorf Mastercycler ep realplex， realplex 2s，Roche Applied Science LightCycler 480，Thermo Scientific PikoReal Cycler，Illumina Eco qPCR，Cepheid SmartCycler，Takara TP-800等机型。以下机型：Applied Biosystems 7000，7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast；StepOne，StepOnePlus等需要添加高浓度ROX Reference Dye。这些机型：Applied Biosystems 7500，7500 Fast，ViiA7；Stratagene MX3000P，MX3005P，MX4000等需要添加低浓度ROX Reference Dye。
【推荐qPCR反应体系（以20 μl体系为例）】
| Component | Volume | Final Concentration |
| 2×qPCR Master Mix(Probe Method) | 10 μl | 1× |
| 10 μM Forward Primer | 0.4 μl | 0.2 μM |
| 10 μM Reverse Primer | 0.4 μl | 0.2 μM |
| 10 μM Probe | 0.4 μl | 0.2 μM |
| PCR-grade Water | Variable | – |
| Template | Variable | As Required |
| Total Volume | 20 μl | – |
反应体系中各成分的量可根据以下原则进行调整：
反应体系中引物终浓度为0.2μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能较差时，引物终浓度可以在0.1 -0.5 μM范围内进行调整；qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确度对最终结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性；如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
【PCR反应条件】
| Step | Temperature | Duration | Cycles |
| UDG pre-treatment | 25℃ | 3 min | 1 |
| Enzyme activation | 94℃ | 10 min | 1 |
| Initial Denaturation | 94℃ | 3 min | 1 |
| Denaturation | 94℃ | 10 sec | 40-45 |
| Annealing/Extensiona | 60℃ | 30 sec |
- 退火/延伸温度根据不同的引物和探针需要进行优化，推荐优化的温度范围为58℃-65℃。退火/延伸时间请根据您使用的Real-time PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整：使用ABI 7700和7900时至少30秒；使用ABI 7000、7300和 7500时34秒。
【注意事项】
- 尽量避免反复冻融，以免酶活下降。如每次使用量较少，推荐分装后保存
- 使用前请上下颠倒混匀预混液，预混液经混匀瞬时离心后即可使用
- qPCR Master Mix(Probe Method)于-20℃保存时，有时会形成沉淀。在室温短时间放置后，涡旋混匀即可完全溶解。确保试剂混合均匀后再使用
- 由于本品检测灵敏度极高，在配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液器，避免污染
【常见问题与解决方案】
1、阴性对照中有信号产生：
模板或试剂被核酸污染：在进行PCR反应前采取标准的预防措施，以降低污染风险
2、定量PCR无扩增曲线：
- 确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序将信号采集设置在退火延伸阶段
- 确认引物是否降解：长时间未使用的引物可能发生降解，合成新的引物，重复实验
- 模板浓度太低或降解：减少稀释度，一般未知浓度的样品按最高浓度进行检测
3、定量PCR扩增曲线不平滑：
- 信号太弱：提高探针浓度或者优化探针浓度
- 定量PCR反应过程中体积变化：PCR管未盖严导致反应体系蒸发
【备注】
本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的合格产品。 在所有情况下，本公司对此产品所承担的责任，仅限于此产品的价值本身。