2× qPCR Master Mix(Probe Method)

货号:A103-5

规格:500rxn(1.0 ml×5支)

保存:-20℃避光保存两年

【产品概述】

本产品是采用探针法进行Real Time PCR(qPCR)检测的试剂。核心组分是基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶,配合针对qPCR优化的反应缓冲液,实现了对PCR抑制物耐受性高、扩增特异性高、扩增效率高、检测灵敏度高等特点。本产品是2×浓度的Premix型试剂,配制qPCR反应体系十分简便。同时,本产品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR产物的交叉污染,数据更准确。使用时只需加入模板、引物、探针和水,使其工作浓度为1×,即可进行反应。此外,本产品适用于快速PCR,可以在宽广的动态范围内对靶基因进行准确定量,检测重复性好,可进行可信度高的Real Time PCR分析。

本品特点:使用化学法修饰的热启动酶,提高灵敏度,增强特异性;使用dUTP和UDG酶,可有效排除先前扩增产物的交叉污染,数据更准确;针对qPCR优化的反应缓冲液,增强特异性,减少引物二聚体形成,提高扩增效率,重复性好,可信度高。

本品不含有用以校准孔间荧光信号差异的ROX Reference Dye,适用于Bio-Rad iCycler CFX96,CFX384,iQ,iQ5,MyiQ,Opticon, Opticon 2,MiniOpticon,Chromo4,Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000,Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2s,Roche Applied Science LightCycler 480,Thermo Scientific PikoReal Cycler,Illumina Eco qPCR,Cepheid SmartCycler,Takara TP-800等机型。以下机型:Applied Biosystems 7000,7300,7700,7900,7900HT,7900HT Fast;StepOne,StepOnePlus等需要添加高浓度ROX Reference Dye。这些机型:Applied Biosystems 7500,7500 Fast,ViiA7;Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000等需要添加低浓度ROX Reference Dye。

【推荐qPCR反应体系(以20 μl体系为例)】

Component Volume Final  Concentration
2×qPCR Master Mix(Probe Method) 10 μl
10 μM Forward Primer 0.4 μl 0.2 μM
10 μM Reverse Primer 0.4 μl 0.2 μM
10 μM Probe 0.4 μl 0.2 μM
PCR-grade Water Variable
Template Variable As Required
Total Volume 20 μl

反应体系中各成分的量可根据以下原则进行调整:

反应体系中引物终浓度为0.2μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能较差时,引物终浓度可以在0.1 -0.5 μM范围内进行调整;qPCR灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确度对最终结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中,这样可以有效提高实验的重复性;如模板为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

【PCR反应条件】

Step Temperature Duration Cycles
UDG pre-treatment 25℃ 3 min 1
Enzyme activation 94℃ 10 min 1
Initial Denaturation 94℃ 3 min 1
Denaturation 94℃ 10 sec 40-45
Annealing/Extensiona 60℃ 30 sec
  • 退火/延伸温度根据不同的引物和探针需要进行优化,推荐优化的温度范围为58℃-65℃。退火/延伸时间请根据您使用的Real-time PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整:使用ABI 7700和7900时至少30秒;使用ABI 7000、7300和 7500时34秒。

【注意事项】

  • 尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐分装后保存
  • 使用前请上下颠倒混匀预混液,预混液经混匀瞬时离心后即可使用
  • qPCR Master Mix(Probe Method)于-20℃保存时,有时会形成沉淀。在室温短时间放置后,涡旋混匀即可完全溶解。确保试剂混合均匀后再使用
  • 由于本品检测灵敏度极高,在配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管,条件容许的实验室推荐使用专用的移液器,避免污染

【常见问题与解决方案】

1、阴性对照中有信号产生:

模板或试剂被核酸污染:在进行PCR反应前采取标准的预防措施,以降低污染风险

2、定量PCR无扩增曲线:

  • 确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序将信号采集设置在退火延伸阶段
  • 确认引物是否降解:长时间未使用的引物可能发生降解,合成新的引物,重复实验
  • 模板浓度太低或降解:减少稀释度,一般未知浓度的样品按最高浓度进行检测

3、定量PCR扩增曲线不平滑:

  • 信号太弱:提高探针浓度或者优化探针浓度
  • 定量PCR反应过程中体积变化:PCR管未盖严导致反应体系蒸发

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的合格产品。 在所有情况下,本公司对此产品所承担的责任,仅限于此产品的价值本身。

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