染料法定量PCR MIX(2× SYBR qPCR Master Mix)

货号:A101-5
规格:500rxn(1.0 ml×5支)
保存:-20℃避光保存两年
【产品概述】
本产品是使用SYBR GreenI 嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。核心组分(包含热启动Taq酶,UDG酶, dNTPs, dUTP, Mg2+, SYBRGreenI等)是基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶,配合针对qPCR优化的反应缓冲液,可以有效抑制非特异性扩增,显著提高扩增效率,从而对靶基因进行准确定量。同时,本产品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR产物的交叉污染,数据更准确。本产品为2×预混试剂,使用时只需加入模板、引物、ROX  Reference Dye(根据qPCR仪选择)和水,使其工作浓度为1×,即可进行反应。
本品特点:使用化学法修饰的热启动酶,提高灵敏度,增强特异性;使用dUTP和UDG酶,可有效排除先前扩增产物的交叉污染,数据更准确;针对qPCR优化的反应缓冲液,增强特异性,减少引物二聚体形成,提高扩增效率,重复性好,可信度高;本品不含有用以校准孔间荧光信号差异的ROX Reference Dye,适用于Bio-Rad iCycler CFX96,CFX384,iQ,iQ5,MyiQ,Opticon, Opticon 2,MiniOpticon,Chromo4,Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000,Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2s,Roche Applied Science LightCycler 480,Thermo Scientific PikoReal Cycler,Illumina Eco qPCR,Cepheid SmartCycler,Takara TP-800等机型。
【推荐qPCR反应体系(以20 μl体系为例)】

Component Volume Final  Concentration
2× SYBR qPCR Master Mix 10 μl
10 μM Forward Primer 0.4 μl 0.2 μM
10 μM Reverse Primer 0.4 μl 0.2 μM
50×ROX Reference Dye (If Required) 0.4 μl
PCR-grade Water Variable
Template Variable As Required
Total Volume 20 μl

反应体系中各成分的量可根据以下原则进行调整:
反应体系中引物终浓度为0.2μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能较差时,引物终浓度可以在0.1 -0.5 μM范围内进行调整;qPCR灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确度对最终结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中,这样可以有效提高实验的重复性;如模板为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
【PCR反应条件】

Step Temperature Duration Cycles
UDG pre-treatment 50℃ 2 min 1
Enzyme activation 94℃ 10 min 1
Initial Denaturation 95℃ 3 min 1
Denaturation 95℃ 10 sec 40
Annealing/Extension 60℃ 30 sec
Melt curve As Required As Required 1

【注意事项】

  • 本品尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐分装后保存
  • 使用前请上下颠倒混匀预混液,预混液经混匀瞬时离心后即可使用
  • 2×SYBR qPCR Master Mix于-20℃保存时,有时会形成沉淀。在室温短时间放置后,涡旋混匀即可完全溶解。确保试剂混合均匀后再使用
  • 本品含有荧光染料SYBR GreenI,保存以及配制反应体系时应尽量避免强光照射
  • 由于本品检测灵敏度极高,在配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管,条件容许的实验室推荐使用专用的移液器,避免污染

【常见问题与解决方案】
1、阴性对照中有信号产生:
a) 模板或试剂被核酸污染:在进行PCR反应前采取标准的预防措施,以降低污染风险
b) 产生引物二聚体:配合融解曲线进行分析
2、融解曲线出现多个峰:
a) 存在引物二聚体或其他特殊结构:根据设计原则设计合成新的引物
b) 引物浓度太高:适当降低引物浓度
c) cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板
3、定量PCR无扩增曲线:
a) 确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序将信号采集设置在退火延伸阶段
b) 确认引物是否降解:长时间未使用的引物可能发生降解,合成新的引物,重复实验
c) 模板浓度太低或降解:减少稀释度,一般未知浓度的样品按最高浓度进行检测
4、定量PCR扩增曲线不平滑:
a) 信号太弱:提高模板浓度重复实验
b) ROX类型使用错误:确认所用ROX与机型是否匹配
c) 定量PCR反应过程中体积变化:PCR管未盖严导致反应体系蒸发
5、Ct值出现太晚:
a) 扩增效率低:优化反应条件,或者重新设计合成引物
b) 模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品按最高浓度进行检测
c) 模板降解:重新制备模板,重复实验
d) PCR产物太长:推荐PCR产物长度为90-200bp
【备注】
本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的合格产品。 在所有情况下,本公司对此产品所承担的责任,仅限于此产品的价值本身。

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