无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning and Assembly Kit)

货号:A104-5
规格:10T(50μl)×5支
保存:-20℃避光保存两年
【产品概述】
基于重组原理的无缝克隆技术,作为新一代的克隆方法,不依赖于繁琐的酶切、回收、连接等操作,通过DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组,可将DNA片段克隆至任意线性化载体任意位点,载体自连背景极低。无缝克隆技术是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。Seamless Cloning and Assembly Kit作为升级版的无缝克隆及多片段重组试剂盒,一个反应可实现两个或多个DNA片段的重组,且阳性率高于95%。
【适用范围】
基因定向克隆,多片段重组。
【实验流程】

【ExonArt Seamless Cloning and Assembly试剂盒实验方案】
1. 线性化载体制备
采用酶切或反向PCR扩增方法将载体线性化。
a. 酶切制备:
选择合适的位点,单酶切或双酶切皆可。若使用单酶切进行线性化,可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。酶切完成后,应将限制性内切酶失活或对线性化载体纯化后再用于重组反应。
注1 : 载体酶切一定要完全,否则未切开的载体会影响后续阳性克隆的鉴定;
注2 : 经双酶切进行线性化无需去磷酸化,经单酶切则需要去磷酸化。
b. 反向PCR扩增制备
为减少扩增突变的引入,推荐使用高保真的聚合酶进行扩增。推荐使用线性化质粒做模板,以减少环状质粒模板残留对后续阳性克隆的鉴定。
注:如果使用环状质粒做模板,应使用DpnI对环状质粒进行降解,再用于后续重组反应。
2. 插入片段PCR引物设计
PCR引物的5′ 端必须包含与其相邻片段(其他插入片段或载体)末端同源的15~25 nt(推荐使用20 nt)序列。
插入片段正向扩增引物:
5′-载体上游末端同源序列+酶切位点(可选)+基因特异性正向配对序列-3′
插入片段反向扩增引物:
3′- 基因特异性反向配对序列+酶切位点(可选)+载体下游末端同源序列-5′

注:尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆,当酶切位点25 nt区域内含量为40~60%
时,重组效率最高。

  1. 插入片段PCR扩增

推荐使用高保真的聚合酶进行扩增,以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行重组反应。若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物,可直接使用,但加样体积应不超过总反应体积的20%。

  1. 重组反应:

配制以下反应体系

组分 反应体系
Seamless Cloning and Assembly kit 5 μl
线性化载体 50~200 ng
插入片段 10~200 ng
Sterilized ddH2O 补足至10 μl

重组反应体系配制完成后,用移液枪轻轻吹打混匀各组分后进行瞬时离心,避免气泡产生,切勿涡旋。

注1 : 插入片段与载体在重组时为相同摩尔数;

注2 : 若插入片段的长度小于200 bp,则插入片段与载体的摩尔比应调整为5:1;

注3 : 当1~2个DNA片段插入载体时,DNA总量推荐为0.02~0.5 pmols;当4~6个DNA片段插入载体时,DNA总量推荐为0.2~1 pmols;

注4 : DNA摩尔数与质量换算公式:pmols=(weight in ng)×1000/(base pairs×650 daltons) ;例如,200 ng的5000 bp载体为0.06 pmols;

注5 : 载体片段过长、插入片段过长或片段数过多,克隆数及阳性克隆率均会降低。

  1. 将反应体系置于50℃,反应15~60 min。

注1:推荐使用PCR仪等温控比较精确的仪器进行反应,反应时间不足或过长均会影响克隆效率;

注2:插入片段小于500 bp时,推荐反应时间为15 min;

注3:插入片段在4 kb以上时,建议反应时间为45~60 min;

注4:插入3~5个片段时,推荐反应时间为45~60 min。

  1. 重组反应完成后,将反应体系进行瞬时离心,置于冰上冷却,用于转化或者冻存于-20℃备用。

注:-20℃冻存的重组产物,建议在1周内使用。

  1. 重组产物转化

取5~10 μl重组产物,加入到100 μl感受态细胞中,缓慢吹打混匀,冰上放置30 min。42℃热激90 sec,冰上放置3 min,加800 μl SOC或LB培养基,37℃振荡培养45~60 min。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上,倒置于37℃过夜培养。

注:不同感受态细胞最后的克隆数及克隆阳性率有所差别,推荐使用转化效率大于108 CFU/μg的感受态细胞。

【常见问题】

1.转化效率低:感受态效率低下;DNA片段纯度不够;重组反应抑制物;DNA片段比例不佳。

2.克隆阳性率低:载体线性化不完全;相同抗性质粒污染;平板抗性不足。

3.大量克隆含有不正确的插入片段:非特异性PCR扩增产物。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的合格产品。 在所有情况下,本公司对此产品所承担的责任,仅限于此产品的价值本身。

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