MICRORNA 靶基因验证实验

服务价格及周期:

服务编号 服务内容 价格 服务周期
MRNA-1 靶基因3′-UTR双荧光素酶野生型载体(‹1.5kb) 1500元 1-2周
MRNA-2 靶基因3′-UTR双荧光素酶突变型载体(一个位点) 900元 1-2周
MRNA-3 质粒提取(两个靶基因加一个对照质粒) 900元 1-2周
MRNA-4 miRNA表达载体或mimic与双荧光素酶载体共转染(96孔板),双荧光素酶检测 5000元 1-2周

microRNA靶基因验证实验概述

当前,microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。本公司可为您提供microRNA报告基因载体构建服务,并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列,我们专业的技术服务人员就可替您完成载体构建,为您节省大量的时间和精力。

下图为microRNA-reporter载体表达框架示意图,具有多克隆位点,方便插入目的靶点序列。psiCHECK-2载体用于终点法的细胞裂解物检测,包含萤火虫荧光素酶基因,使海肾荧光素酶的表达水平归一化,令该系统更可靠、重现性更好。使用psiCHECK-2载体时,由于是一个载体,无须通过共转染进行归一化。

microRNA报告基因实验流程:

构建miR-reporter载体(含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体)与内参质粒、microRNA mimics或 microRNA negativecontrol共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,进一步验确定目的 microRNA的靶基因。

1.microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列。
2.获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列,合成两条互补的单链DNA模板。或者,设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列,或直接合成。
3.microRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链(具有粘性末端),或将PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.阳性克隆鉴定
挑选转化的菌落,PCR筛选含有插入片段的阳性克隆,测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.细胞转染准备
将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.荧光素酶检测
共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。

整理分析数据,得出结论:
提供有microRNA靶序列的报告质粒,以及内参和对照质粒各一份。
甘油保存菌株各一支。
附mir-reporter载体的说明书
以及实验报告:
包括载体构建过程,鉴定记录,测序报告,细胞转染,荧光检测。

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