双荧光素酶检测启动子活性试验

双荧光素酶报告基因试验(luciferase Assay)目前由两个主要的应用方向,第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用,转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。双荧光素酶报告基因实验(luciferase Assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段,第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控,通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列,并设计合适的microRNA质粒或干预片段,同时构建靶基因的报告基因质粒,二者同时转染细胞,这是确定microRNA是否能影响(上调或下调)靶基因的首选研究方法。

实验步骤:

1. 质粒转染细胞:
1) 细胞铺板:将细胞按70%的汇合度接种到96孔板;
2) 转染:16h后转染萤光素酶报告基因质粒,每个样品设置3个复孔;
a) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为pG3-basic:pR-TK:转染试剂 = 100ng:100ng:0.25μL;
b) 稀释好DNA及转染试剂,常温孵育5min;
c) 将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀,常温孵育20min;
d) 每孔弃去15μL培养基,将15μL DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中;
e) 转染6h后,换新鲜完全培养基。

2. 双报告基因检测
a) 质粒共转染48h后,弃去培养基,用100μL 1XPBS洗1遍;
b) 倾斜96孔板,吸干剩余的PBS;
c) 去离子水将5XPLB稀释成1XPLB,使用前放到常温;
d) 每孔加50μL稀释好的 1X PLB,摇床常温条件下摇15min,进行裂解;
e) 白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL, 加入100μL预先混好的LAR II,2s后测数据;
f) 每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent,静止2s后,测数据;
注意:进行Luciferase活性检测时,需在避光条件下进行。

服务价格及周期:

服务编号 服务内容 价格 服务周期
SXGS-1 从基因组钓取启动子或合成 >1000元 1-2周
SYGX-2 构建含有目的启动子的报告基因表达载体 800元 1-2周
SYGX-2 质粒提取 300元 1-2周
SXGS-3 质粒转染目的细胞和细胞处理(按孔计算,200元/孔,96孔板) 200元 1-2周
SXGS-4 双荧光素酶检测(按孔计算,100元/孔,1000元起) 100元 1-2周

客户须知:

(1)客户提供启动子序列或者我们免费用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。
(3)筛选阳性克隆,测序,扩增克隆并提纯质粒备用。
(4)扩增转录因子质粒(或microRNA质粒),提纯备用,同时准备相应的空载质粒对照。
(5)培养293细胞(或其它目的细胞),并接种于6孔板中,生长24h(80%汇合度)。
(6)将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
(7)用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。
(8)加入酶作用底物,于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。
(9)计算相对荧光强度,并与空载对照比较,判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
(10)需要收取一定的细胞培养费用另算。

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注