TUNEL检测

TUNEL检测
细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
实验方法
1. 对于贴壁细胞或细胞涂片
A1. PBS或HBSS洗涤一次
B1. 如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢
C1. 用4%多聚甲醛或其他免疫染色固定液固定细胞30-60分钟
D1. 用PBS或HBSS洗涤一次
E1. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或其他免疫染色洗涤液,冰浴孵育2分钟。
F3. 转步骤5
2.对于悬浮细胞或细胞悬液
A2. 收集细胞(不超过200万细胞),PBS或HBSS洗涤一次
B2. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团,宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定
C2. 用PBS或HBSS洗涤一次
D2. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞,冰浴孵育2分钟
E2. 转步骤5。
3.对于石蜡切片
A3. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟,蒸馏水2分钟
B3.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K,20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)
C3. PBS或HBSS洗涤3次。注意:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应
D3. 转步骤5
4. 对于冷冻切片

  1. A4. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟
  2. B4. PBS或HBSS洗涤2次,每次10分钟
  3. C4. 加入含0.1% Triton X-100的PBS,冰浴孵育2分钟
  4. D4. 转步骤5

5. 配制TUNEL检测液
参考下表配制适当量的TUNEL检测液,需充分混匀。注意:配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕,不能冻存

1个样品 5个样品 10个样品
TdT酶 2μl 10μl 20μl
荧光标记液 48μl 240μl 480μl
TUNEL检测液 50μl 250μl 500μl

6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片

  • a. 用PBS或HBSS洗涤2次
  • b. 在样品上加50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟。注意:孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润,以尽量减少TUNEL检测液的蒸发
  • c. PBS或HBSS洗涤3次
  • d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)

7. 对于悬浮细胞或细胞悬液

  • a. 用PBS或HBSS洗涤2次
  • b. 加入50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟
  • c. PBS或HBSS洗涤2次
  • d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮
  • e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)

常见问题
1. 出现非特异性荧光标记

  • a1. 有些细胞或组织,例如平滑肌细胞或组织,nuclease或polymerase的酶活性水平较高,易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是,取细胞或组织后立即固定并且要充分固定,以阻止这些酶导致假阳性
  • b1. 使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液,导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液
  • c1. TUNEL检测反应时间过长,或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润,也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间,并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品

2. 荧光背景很高

  • a2. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
  • b2. 高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂
  • c2. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用
  • d2. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒

3. 标记效率低

  • a3. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低
  • b3. 固定时间过长,导致交联程度过高。此时宜减少固定时间
  • c3. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作
  • d3. 碘化丙啶双染时,如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光,从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色,例如0.5μg/ml碘化丙啶。

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